Calculadora de Eficiencia qPCR: ¿Cómo Calcular la Eficiencia del PCR en Tiempo Real?

Utiliza esta calculadora de eficiencia qPCR para determinar la eficiencia de tu ensayo de PCR a partir de la pendiente de la curva estándar. Para verificar que tu PCR se ejecuta eficientemente, debes obtener una eficiencia qPCR aceptable del 90 al 100%, lo que significa que el número de moléculas en la secuencia objetivo se duplicó durante cada ciclo de replicación.

¿Cómo Calcular la Eficiencia del Primer?

La eficiencia del PCR, expresada en porcentaje (%), nos indica qué tan bien funcionó nuestro ensayo de PCR. Se trata de la relación de duplicación de la secuencia objetivo. Si la eficiencia del primer qPCR es del 100%, significa que nuestra secuencia objetivo se duplicó en cada ciclo de PCR y la enzima polimerasa y los cebadores funcionan al máximo de su capacidad; ese es nuestro objetivo.

Calculamos la eficiencia del PCR para determinar la confiabilidad y precisión de nuestro ensayo y para comparar diferentes ensayos entre sí. Normalmente, se ejecuta un experimento de curva estándar con una serie de diluciones. El valor resultante de Ct (umbral de ciclo) se grafica en función del logaritmo del nivel de entrada de ácido nucleico para generar un gráfico lineal. Utilizamos la pendiente de este gráfico para determinar la eficiencia de la reacción de PCR.

Interpretación de los Resultados de la Eficiencia qPCR

La eficiencia de <90% o ≥110% es inaceptable e indica que se requiere una mayor optimización del ensayo. Necesitas comprender cómo usar nuestra calculadora de eficiencia qPCR, la ecuación y cómo interpretar los resultados correctamente.

La calculadora de eficiencia qPCR asume que en el diagrama de la curva estándar, se grafica el logaritmo de las copias de ADN en el eje x y el Ct en el eje y. Sigue estos fáciles pasos para calcular la eficiencia qPCR:

1. Encuentra la pendiente de tu curva de dilución estándar; por ejemplo, tomemos un valor de -3.35.
2. Ingresa el valor de la pendiente en el primer campo de la calculadora.
3. ¡Eso es todo lo que necesitas hacer! La calculadora determinará la eficiencia del primer qPCR en porcentaje y el factor de amplificación.

Asegúrate de seguir las recomendaciones proporcionadas por los kits y reactivos de PCR que utilizas. Utiliza al menos 5 puntos de dilución con diluciones de 10 veces; ejecuta al menos triplicados de cada punto de dilución; si tienes 1 o más valores atípicos en la curva estándar, repite la curva; verifica R² y los valores atípicos después de la corrida; utiliza el principio de los cuatro ojos; utiliza solo ADN de plantilla puro y mantiene tu lugar de trabajo limpio y desinfectado; asegúrate de que tus pipetas estén correctamente calibradas; ajusta las concentraciones de cebadores y sondas; y verifica la especificidad con tintes fluorescentes que se unen al ADN.

Una eficiencia de PCR perfecta se expresa como 100% (igual a una pendiente de curva estándar de -3.322), lo que significa que todo el ADN objetivo se duplicó en cada ciclo de PCR. Los resultados entre 90% y 100% son aceptables. Factores que pueden llevar a una eficiencia PCR teórica mayor de 100% incluyen inhibidores, contaminación, errores de precisión de pipetas, puntos de dilución incorrectos o valores en la fase no lineal de la reacción. Al ajustar tu ensayo de PCR, cambia solo uno o algunos parámetros a la vez para determinar con precisión la causa del error inicial.